再帕爾·阿不力孜團隊發表《AnalyticalChemistry》封面文章

　　2021年4月，中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室再帕爾·阿不力孜、賀玖明團隊在分析化學一區《Analytical Chemistry》期刊發表封面文章，題為“Mapping metabolic networks in the brain by using ambient mass spectrometry imaging and metabolomics”的研究成果，通過空間代謝組學技術，全面揭示了大鼠腦代謝網絡，深入解析了東莨菪堿致大鼠記憶功能障礙模型腦的代謝變化。

圖 | 封面文章

　　中文標題：使用敞開式質譜成像技術及代謝組學繪制大鼠腦代謝網絡圖

　　研究對象：大鼠腦

　　發表期刊：Analytical Chemistry

　　影響因子：6.785

　　發表時間：2021年4月23日

　　研究單位：中國醫學科學院藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室

　　運用生物技術：空間代謝組學（AFAI-MSI）

　　● 研究背景

　　大腦是結構最復雜的器官之一，主要功能與其微區的分子相互作用密切相關。大腦的小分子調節機制對理解中樞神經功能、精神疾病機理和藥物研發有很大的幫助。動物的認知過程和行為控制均依賴于腦部強大的中樞神經網絡——神經連接體。科學家進行了很多研究，但是對腦部小分子網絡的研究仍有不足。

　　分子成像技術是研究大腦中DNA、RNA、蛋白質和代謝產物的強大工具。質譜成像技術（MSI）是一種檢測大腦中蛋白質、代謝物和脂質物質的高靈敏度和高通量分子成像技術，在腫瘤邊緣診斷、腫瘤生物標志物發現、藥物分布和機理闡述等領域有廣泛的應用。

　　本文作者開發了一種基于敞開式空氣動力輔助解吸電噴霧離子化質譜成像（AFADESI-MSI）技術的代謝網絡映射方法，對大鼠腦不同極性的小分子代謝物（m/z 50-500 Da）進行微區分布研究，不僅鑒定出腦部幾乎所有重要的代謝物，還繪制了包含神經遞質、嘌呤，有機酸，多胺，膽堿、碳水化合物和脂類等20條通路的代謝網絡，并使用這種代謝網絡映射質譜成像方法解析了東莨菪堿致大鼠記憶功能障礙模型腦的代謝變化，為中樞神經系統疾病的治療提供新的信息和見解。

　　● 研究思路

　　● 研究方法

　　1.樣本準備

　　Sprague-Dawley大鼠模型腹腔注射東莨菪堿后被殺死（處理組，3只），對照組大鼠（3只）也用同樣方法殺死。獲取大鼠整個大腦，在低溫下將大腦切成連續的矢狀切片（暴露出海馬和紋狀體），用于Nissl 染色、H&E染色和質譜成像檢測。

　　2.空間代謝組實驗

　　使用AFADESI-MSI分析，代謝物質量數范圍50-500 Da，質譜分辨率70,000。

　　3.數據處理和代謝網絡分析

　　原始數據經過轉化，再使用自建MassImager軟件獲取成像結果；在獲取差異代謝物的高分辨率質譜信息后，使用Metaboanalys在線數據挖掘軟件以褐家鼠（rattus norvegicus）為參考完成代謝物高通量定性，并輸出代謝網絡信息。大腦中復雜網絡可視化使用Cyctoscope軟件完成。

　　4.統計分析

　　兩組大腦樣本選擇相同的微區，并將組織學和特征離子圖像疊加進行確認。數據處理結果使用t檢驗（n = 3）進一步驗證。大腦微區包括松果體、中腦導水管、腦橋、梨狀皮質、延髓、丘腦、紋狀體、海馬、胼胝體、嗅球、大腦皮層、小腦皮層、穹窿、小腦延髓和丘腦。

　　● 研究結果

　　1.AFADESI-MSI用于大腦中極性代謝物的定位

　　如圖1所示，將大鼠大腦連續矢狀切面通過ESI探針對逐個像素進行掃描，并將解吸的代謝物離子傳輸到高分辨率質量分析儀進行分析。圖1E是大鼠腦部某個像素點的一個代表性質譜圖，在該圖中可以觀察到數千個代謝物的峰。AFADESI-MSI圖像還表明腦部不同功能性區域中代謝物濃度的變化。圖1A-D顯示了代表性代謝產物圖像，在松果體、紋狀體、海馬、胼胝體和嗅球等亞區域具有特定分布。這些異質代謝分布與大鼠腦的功能和結構復雜性高度一致。

　　實驗結果表明，AFADESI-MSI的空間分辨率小于100μm，代謝物質量最大差異為0.001Da，同一物質的檢測動態范圍高達1000倍。如圖1所示，通過AFADESI-MSI可在大鼠腦部檢測到一些呈特征性分布有代表性的極性代謝物，其強度范圍從0到104甚至到106。

圖1 |（A-E）使用AFADESI-MSI獲得的用于構建大鼠大腦代謝網絡圖的代表性極性內源性代謝物；

　（F）AFADESI-MSI數據采集過程；

　　2.在大鼠腦繪制特定區域分布的極性代謝物圖譜

　　使用AFADESI-MSI在正離子和負離子模式下分別獲得298個和372個微區輪廓清晰的代謝物離子圖像。使用精確分子量并結合同位素豐度，通過人類代謝組數據庫（HMDB）對離子圖像進行識別，鑒定出多種內源極性代謝物，包括氨基酸、核苷酸或核苷、碳水化合物、脂肪酸和神經遞質等。

　　中樞神經系統（CNS）的特定功能和特定解剖區域相關。例如，乙酰膽堿在大腦皮層中高度表達；γ-氨基丁酸是一種抑制性神經遞質，其在大腦皮層的信號強度較低，在中腦、嗅球和下丘腦中的濃度較高；多巴胺在紋狀體含量較高；組胺（一種興奮性神經遞質）主要分布于丘腦和下丘腦。松果體在睡眠和光周期調節中起著重要的作用，并且由于其體積小容易被忽視。在松果體區域中，作者檢測到106種極性代謝物，例如吲哚乙醛、吲哚、5'-甲硫基腺苷和褪黑激素，它們在該微結構的表達最高。褪黑激素由松果體分泌，起到調節晝夜節律的作用。質譜成像結果表明褪黑激素只能在松果體檢測到。褪黑激素的上游代謝物血清素（5-HT）在松果體中也有特定的分布。此外一些未知的代謝物也僅在大鼠大腦的某個很小但特定的區域中。以上結果表明，AFADESI-MSI方法可以直接檢測極性代謝產物，并具有高特異性，能呈現其在大腦微區分布的圖像。

　　3.在大鼠腦中繪制微區代謝網絡圖

　　要了解大腦的結構區域發生的復雜代謝過程，不僅應準確表征代謝物，還要研究其相關性。從大鼠腦微區中提取代謝譜進行代謝網絡重建。從15個微區提取的MSI數據進行峰挑選和峰對齊（圖1F），包括松果體、中腦導水管、腦橋、梨狀皮質、延髓、丘腦、紋狀體、海馬、胼胝體、嗅球、大腦皮層、小腦皮層、穹窿、小腦延髓和丘腦，然后使用基于KEGG數據庫的Metaboanalyst軟件進行代謝網絡分析。共找到20條KEGG代謝通路，包含126個具有微區信息的代謝物，圖2顯示了涉及丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、花生四烯酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、肌酸途徑、GABA能突觸、葡萄糖代謝、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝、甘氨酸-絲氨酸和蘇氨酸的代謝、組氨酸代謝、賴氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、多胺代謝途徑、嘌呤代謝、嘧啶代謝和TCA循環、色氨酸代謝、酪氨酸代謝、纈氨酸-亮氨酸和異亮氨酸代謝和類固醇激素合成途徑。質譜成像方法提供了一種直接獲取代謝網絡信息的途徑，以系統地深入了解大腦的代謝活動。

圖2 | 通過AFADESI-MSI和Metaboanalyst獲得的大鼠腦中的代謝網絡

　　圖3A展示了嘌呤代謝的分布和代謝途徑，共包含17個核苷酸及相關代謝產物，餅圖代表了某種代謝物在不同大腦微區的相對含量和分布，圖3A中顯示出不同代謝物的不同局部特征。例如腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）在大腦皮層和松果體中高表達，但在胼胝體和穹窿中含量較低。圖3B顯示了大腦不同區域的AMP分布，AMP在大腦皮層和松果體中含量很高，而在胼胝體和穹窿中含量較低。這些結果表明，大腦中代謝物分布呈現出功能性區域的差異性。這些空間和代謝途徑的上游-下游轉換過程為大腦局部代謝活動提供豐富信息。也證明質譜成像方法能夠提供直接獲取代謝網絡信息的方法。

圖3 |（A）通過AFADESI-MSI獲得的大鼠腦中嘌呤代謝途徑和相關代謝產物分布；

（B）腺嘌呤核糖核苷酸（AMP）在大鼠腦不同區域的分布；

　　4.神經遞質的代謝網絡解析

　　神經遞質在大腦不同區域具有極為復雜的代謝調節網絡，使這些區域的中樞神經能夠從事復雜的活動。作者分析了關鍵神經遞質的代謝調控網絡，分別為多巴胺、γ-氨基丁酸、腺苷、組胺、乙酰膽堿、5-羥色胺、谷氨酸和谷氨酰胺。圖4A顯示了神經遞質以及相關代謝產物在大鼠腦的分布特征，它們聯系非常緊密（圖4B），這些神經元彼此相互作用并形成復雜的調節網絡。

圖4 |（A）大鼠腦中神經遞質及其相關代謝產物的分布；

（B）神經遞質調節和代謝網絡；

　　5.從大鼠腦的代謝網絡映射中發掘空間變化

　　東莨菪堿治療的大鼠是一種學習和記憶障礙模型，通常用于研究抗遺忘藥療效。本文作者使用AFADESI-MSI分析了對照組和東莨菪堿治療的大鼠矢狀腦切片，將發現的代謝物全面映射代謝網絡，并通過代謝組學分析發現空間代謝變化。不僅可以對藥物準確定量，還可以檢測代謝網絡相關的數百種內源性代謝物在大腦特定區域的分布。圖5顯示了代謝網絡中檢測到的各種代謝物，以及在不同大腦微區代謝物的明顯改變。如圖5A所示，找到三種代謝物（N-甲酰基尿氨酸、L-色氨酸和5-羥色氨酸），屬于色氨酸代謝途徑，意味著東莨菪堿會干擾色氨酸的代謝過程。作者分析了東莨菪堿治療組大鼠腦的十個微區，發現腦橋中有16種表達異常的代謝產物，而在大腦皮層中發現了7種。表明在東莨菪堿治療下，腦橋和大腦皮層可能是受影響最嚴重的區域。

圖5 | 東莨菪堿模型大腦中極性代謝網絡的變化

　　圖6顯示了其中幾種異常表達的代謝產物的分布，例如腺嘌呤在小腦皮層被下調；組胺在中腦導水管中下調；橋腦中的磷酸乙醇胺、大腦皮層中的2-氧戊二酸、紋狀體中的多巴胺、胼胝體中的抗壞血酸、下丘腦中的谷胱甘肽、小腦皮層中的L-天冬氨酸和L-天冬氨酸也有所變化，這些代謝物的質譜成像結果（圖6A-H）和相對定量結果（圖6I1-18）進一步表明，大腦中藥物作用后代謝物的多樣性和區域特異性。這些代謝物不分區分析、含量進行全腦平均后，代謝物的微區含量差異很容易被削減。在空間上的代謝變化表明，在東莨菪堿治療后，大鼠腦微區的代謝網絡發生紊亂。但是代謝物和代謝酶是代謝網絡的關鍵因素，基于空間分辨的代謝組學信息為發現酶或基因異常提供了線索，但若要完成完整的代謝網絡分析必須進一步驗證蛋白質和基因表達水平。

圖6 | 在東莨菪堿治療后大鼠模型的腦部質譜成像結果和代謝產物的統計結果

　　● 研究結論

　　本文作者開發了一種空間分辨代謝網絡作圖方法，通過無需衍生化、特定標記或復雜樣品預處理的高通量AFADESI-MSI方法和代謝組學策略，在具有復雜結構化腦組織中發現代謝分子變化。能檢測出多種極性內源性代謝物，并繪制相關代謝網絡，提供組織微區分布的圖譜。還將多種功能性小分子（例如核苷酸、多胺、肌酸、神經酰胺代謝物）含量分布可視化。這些代謝物構成大鼠腦關鍵代謝網絡，為理解大鼠腦的作用機制和功能探索提供新的見解。在本文中，該方法被用于東莨菪堿處理的大鼠模型腦部的代謝研究。結合微區統計數據，該方法可以繪制代謝網絡圖、發現某些途徑代謝產物的明顯失調，而且還能描繪與神經疾病直接相關微區中發生的代謝變化。

（文章來源：鹿明生物）