內切酶的特性、酶解與瓊脂糖凝膠電泳

學習和掌握限制性內切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法，理解限制性內切酶是DNA重組技術的關鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。

限制性核酸內切酶：

是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。

瓊脂糖凝膠電泳：

是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA片段。

EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽, (Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現出紅色熒光，易于檢測。可以檢測10ng 的DNA。

質粒 pCMV-Myc-T10 NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸內切酶(Takara) EcoR 1和 Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer) 瓊脂糖 TBE或TAE緩沖液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(6×)：0.25% 溴酚蘭，40%(W/V)蔗糖 水溶液或30%的甘油。 電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等 .

1) 質粒DNA的酶解(自提質粒pCMV-Myc-T10)

* 緩沖液隨不同的酶而不同,本實驗用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小時。酶解完成后，分鵂尤?0?l 3倍的上樣緩沖液, 然后各取15?l進行電泳分析。

2) 瓊脂糖凝膠的制備:

稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。

3)膠板的制備:

取有機玻璃內槽，洗凈、晾干;取紙膠條(寬約1cm)，將有機玻璃內槽置于一水平位置模具上，放好梳子。 將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機玻璃內槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機玻璃內槽放在含有0.5-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的電泳槽中使用。

4)加樣:

用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內。每加完一個樣品，換一個加樣頭。加樣時應防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實驗樣品孔容量約15～20 ul。1 kb DNA ladder(共10條帶): 在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內加入6ul 的 1 kb DNA ladder(50ng/ul )。

5)電泳(帶上手套操作):

加完樣后的凝膠板即可通電進行電泳;

建議在80～100V的電壓下電泳;

當溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳;

將凝膠放入溴化乙啶(EB〕工作液(0.5ug/ml左右)中染色約20min。