膽固醇是絕大多數膽結石的主要成分，它極難溶于水，而膽汁內的膽固醇能以膽鹽-磷脂微膠粒和磷脂微囊形式溶于水。以這兩種形式，膽汁攜帶膽固醇的能力可大大加強。膽鹽微膠粒由膽鹽分子聚合而成，其分子中水溶性（離子）區域朝向水溶液，而非水溶性（非極性）膽固醇核朝內。膽固醇即溶于球形微膠粒內部，而且其攜帶膽固醇的能力可因一種極性磷脂，即卵磷脂而進一步加強。膽汁以微囊和微膠粒形式所攜帶的膽固醇的量隨膽鹽分泌速率的變化而變化。
膽汁中膽固醇的過度飽和是膽固醇結石形成的必要條件，但并不是唯一原因。因為在沒有膽結石的禁食者，其膽固醇往往也呈過度飽和狀態。其他決定膽結石形成的關鍵因素包括膽石形成的最初過程，即膽固醇單個化合物結晶形成的調節。在易形成結石的膽囊膽汁中，膽固醇呈過度飽和狀態，而且膽固醇結晶的結晶過程也相對較快。正常時膽囊內促進與對抗膽固醇結晶聚合的力量形成一種動態平衡，這包括一些特殊蛋白質或載脂蛋白，膽囊粘蛋白及膽囊膽汁淤滯的作用。
實質上，所有膽結石都是在膽囊內形成的，但在由于膽汁淤積所致的膽囊管狹窄處后端和膽囊切除后的膽管內亦可形成結石。
膽固醇代謝（cholesterol metabolism） 機體內膽固醇來源于食物及生物合成。成年人除腦組織外各種組織都能合成膽固醇，其中肝臟和腸粘膜是合成的主要場所。體內膽固醇70～80%由肝臟合成，10%由小腸合成。其他組織如腎上腺皮質、脾臟、卵巢、睪丸及胎盤乃至動脈管壁，也可合成膽固醇。膽固醇的合成主要在胞漿和內質網中進行。膽固醇可以在腸粘膜、肝、紅細胞及腎上腺皮質等組織中酯化成膽固醇酯。