為了避免雜菌污染，獲得微生物純培養物，培養基必須及時嚴格滅菌。通常采用高壓蒸汽滅菌。一般培養基用0. IMPa (121℃)維持15 ~ 30min即可徹底滅菌。長時間的高溫滅菌會使某些不耐熱的物質破壞，如使糖類物質形成氨基糖、焦糖。因此，含糖培養基常用0.05MPa (110℃) 滅菌20 ~ 30min某些對糖類要求更高的培養基，可先將糖過濾除菌或間歇滅菌，再與其他已滅菌的成分混合。長時間高溫滅菌也會使磷酸鹽、碳酸鹽與鈣、鎂鐵等陽離子形成難溶性化合物而產生沉淀。為了防止這類沉淀發生，可將這些物質分別滅菌，冷卻后再混合；也可在培養基中加入少量整合劑(0.01%乙二胺四乙酸，即EDTA)使金屬離子形成可溶性絡合物，防止沉淀的產生。高壓蒸汽滅菌一般使培養基 pH降低， 應在配制培養基時加以調節。