siRNA具有明確定義的結構：具有磷酸化5'末端的短（通常20至24bp）雙鏈RNA（dsRNA）和具有兩個突出核苷酸的羥基化3'末端。該切酶酶催化生產的siRNA由長的dsRNA和小發夾RNA。siRNA也可以通過轉染引入細胞。由于原則上任何基因都可以被具有互補序列的合成siRNA敲低，因此siRNA是在后基因組時代驗證基因功能和藥物靶向的重要工具。
siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：
每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結構是利用一種稱為dicer的酶處理而得，這種酶可以將較長的雙股RNA或小發夾RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可經由多種不同轉染（transfection）技術導入細胞內，并對特定基因產生具專一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用經過適當剪裁的siRNA之互補性，來對已知序列的基因進行標定，這種現象使siRNA成為研究基因功能與藥物目標的一項重要工具。