材料與方法
1.1 血清采集 MG患者全血來自2004～2005年就診于遼寧中醫學院附屬醫院的門診患者。根據典型臨床表現、新斯的明試驗、低頻重復電刺激及單纖維肌電圖等確診，無其他自身免疫性疾病，未經其他免疫抑制治療，并參照1994年版《中醫病證診斷療效標準》辨證為脾腎虛型。正常人血清取自同時期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷凍保存備用。
1.2 主要試劑 固相pH梯度干膠條IPG strip（Amersham公司產品， 非線性pH 3～10， 7 cm）。3-〔3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸鹽｛3-〔（3-cholamidopropyl） dimethylamino〕-1-propanesul-fonate， CHAPS｝，二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol， DTT），三丁基膦（tributyl phosphine， TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide， IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲雙丙烯酰胺（N， N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N， N， N， N-tetram-ethyl-ethylenediamine， TEMED），過硫酰胺（am-monium persulfate， APS），三羥甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl） aminomethane〕、甘氨酸（glycine， Gly）和十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate， SDS）均為Bio-Rad公司產品。瓊脂糖為華美生物公司產品。其他試劑均使用國產分析純試劑。所有溶液均用MilliQ水配制。
1.3 主要儀器 高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司產品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司產品;P-2000分光光度儀，Hitachi公司產品;SE-600電泳儀，Amersham公司產品;純水裝置，Millipore公司產品;GS-710光密度掃描儀，Bio-Rad公司產品;冷卻水循環系統，Cole-Parmer公司產品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美國Bruker-Daltonics公司產品;LCQ Deca XP Plus，美國Thermo Finnigan公司產品。
1.4 雙向電泳
1.4.1 血清總蛋白質的提取及定量 血清-70 ℃反復凍融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column處理去除高豐度蛋白。使用Agilent 5K超濾管進行濃縮除鹽，凍干回收的樣品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、 65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制劑）進行復溶，并采用考馬斯亮藍法進行蛋白質定量。
1.4.2 等電聚焦 自-20 ℃取出的膠條，室溫下平衡10 min，以500 μg上樣量在每份樣本中加入上樣緩沖液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及標準蛋白質分子，上樣于泡脹槽中，加入礦物油覆蓋。程序設置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恒溫20 ℃。等電聚焦電泳后IPG膠條在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素 6 mol/L、甘油 30%、SDS 2%、溴酚藍0.002%和DTT 100 mg）中于振蕩器上振蕩 15 min; 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用 400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同樣于振蕩器上振蕩15 min。
1.4.3 SDS-PAGE垂直電泳 采用12.5%的均勻SDS2聚丙烯酰胺凝膠（水23.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，膠總體積80 ml）。將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，膠條一端放入低分子量蛋白質標準，0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液（Tris 5 mmol/L，Gly 192 mmol/L和SDS 0.1%）。初始電流為每塊膠40 mA，電泳20 min，然后以每塊膠60 mA電流，直至溴酚藍前沿。
1.4.4 銀染色 電泳結束后，采用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。
1.5 圖像分析 每個樣品常規進行3次二維電泳，用GS-710光密度掃描儀對電泳后的膠圖分別進行掃描，所得掃描圖像輸入計算機，采用Image-master軟件對圖像進行背景消減、蛋白質點檢測和校正，獲取蛋白質點的位置坐標和表達量等分析。選取 Ratio ≥1.5的蛋白質點認為有差異。所有數據的統計分析均采用SPSS 12.0軟件，統計學分析采用 t 檢驗。
1.6 基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜分析 用手術刀片切下膠上目標條帶，進行切膠、膠上胰蛋白酶酶解 20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脫鹽后點樣，行基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS）分析（飛行管長2.7 m，加速電壓 20 kV ，反射電壓23 kV）。將第1級質譜得到的肽片段質量指紋圖譜、肽質量指紋圖譜與第2級質譜得到的肽序列信息一起用來檢索蛋白質數據庫，找出匹配的蛋白質。
1.7 數據庫檢索 將質譜鑒定所得的肽質量指紋譜（peptide mass fingerprinting， PMF）數據于Bio-Works（Thermo Finnigan， San Jose， CA）軟件搜索相應的庫。搜索使用的數據庫為IPI human蛋白庫（SEQUEST結果過濾參數為:當Charge+1，Xcorr≥1.9;當Charge+2，Xcorr≥2.2;當Charge+3，Xcorr≥3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上 Homo sapiens的非冗余蛋白庫（redundant data-base）。檢索參數為胰蛋白酶解;氨基酸固定修飾方式為脲甲基半胱氨酸;模式為單同位素峰;肽片斷最大誤差控制在100 ppm;肽片斷最大分子量誤差為±0.5 Da;每個肽允許有1個不完全裂解位點。
2 結果
2.1 脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜 的建立及分析 經2-DE技術及銀染色后，得到了兩組血清的雙向凝膠電泳圖，并于相同的條件下重復實驗3次。在正常對照組細胞蛋白質組雙向電泳圖譜上可觀察到1 463±179個蛋白點，而脾腎虛型重癥肌無力組可見到1 508±89個蛋白點