免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表著機體體液免疫的水平，并進一步代表著B細胞的功能，因此測定血清Ig含量可以推知機體的體液免疫功能和診斷某些疾病引起的Ig的過高和過低。
隨著免疫學的發展和需要，免疫球蛋白的純化和其成分的提純成為必不可少的手段。純化的方法很多，有單一法，但大多數采用二步法以上相結合的方法，特別是以硫酸銨提純為基礎，再經過層析柱的方法來提高免疫球蛋白及其各成分的純度最為常用。
硫酸銨溶液能使蛋白質膠體脫水并中和其電荷而使之沉淀下來（稱為鹽析）。不同濃度的硫酸銨鹽析蛋白成分不同，利用這一原理提取所需的免疫球蛋白成分。鹽析只能粗提，為了獲得純化的免疫球蛋白成分，必須進一步采用層析的方法進行分離。
免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。
一、 IgG的分離與提純
（一）材料與試劑配制
1．動物血清
2．硫酸銨飽和溶液
硫酸銨 800g~850g
H2O 1 000ml
加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以28％NH4OH調pH至7.0（不調pH值也可以）。
注：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入H2S，靜置過夜后濾過，加熱蒸發H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4PB液
A液：0.10Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 15.60g
加H2O至 1 000.ml
B液：0.10Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 35.80g
加H2O至 1 000ml
取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
4．1％BaCl2溶液
5．納氏液
HgI 115.00g
KI 80.00g
加H2O至 500.00ml
溶化后過濾，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。
6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。
7．洗脫液：0.03Mol/L的NaCl液。
8．透析袋（或玻璃紙）。
（二）操作方法
1．取20ml血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成20％(NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。
2．3 000r/min離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。
3．在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液30ml，使成50％(NH4)2SO4溶液，充分混合，靜置30min。
4．3 000r/min離心20min，棄上清。
5．于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液10ml，使成33％(NH4)2SO4溶液，充分混合后，靜置30min。
6． 3 000r/min離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟5，2~3次。
7． 用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。
8． 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于4℃透析24h，中間換液數次。
以1％BaCl2檢查透析液中的SO42-或以納氏試劑檢查NH4+（取3~4ml透析液，加試劑1~2滴，出現磚紅色即認為有NH4+存在），直至無SO42-或NH4+出現為止。也可采用SephadexG25或電透析除鹽。
9． 離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。
10．過DEAE－纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液。
也可采用SephadexG150或G200柱。
11．蛋白質及其定量鑒定（見本章第八節）。
12．IgG的純度鑒定 可采用下列方法之一鑒定。
⑴ 區帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度(NH4)2SO4鹽析樣品進行電泳，以資比較。
⑵ 瓊脂雙相雙擴散鑒定：預先準備該IgG免疫異種動物所獲的抗IgG血清。將IgG與抗IgG血清進行雙相雙擴散，如IgG提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉淀線。
⑶ 免疫電泳鑒定：（操作見第三章免疫電泳部分）。孔內加待測樣品，電泳后，在槽內加抗IgG血清，瓊脂擴散24h，觀察結果。如果提取的IgG純的話，則只出現一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。
⑷ 圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的IgG則只有一條區帶。
13．IgG的濃縮與保存
⑴ IgG的濃縮：參看本章第九節。
⑵ IgG的保存：一般濃縮至1％以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。
（三）IgG的簡易快速提取法
應用硫酸銨鹽析及DEAE-纖維素層析法提純化的IgG，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取IgG時，則往往采取下列的簡易辦法。
1． DEAE-纖維素直接提取法
取樣品直接過DEAE-纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。
⑴ 以一定數量的DEAE52放入燒杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液，靜置30min，去上清細粒，再重復一次。
⑵用布氏漏斗（內放兩層濾紙）過濾。
⑶以5g濕重的DEAE-纖維素加1ml血清及3ml蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。
⑷于4℃中放置1h，中間攪拌數次。
⑸用布氏漏斗抽濾，再用0.01Mol/L pH8.0PB緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的IgG液。
2．DEAE－SephadexA－50為弱堿性陰離子交換劑，經NaOH將Cl-型轉變為OH-型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的pH在6.5時，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用這一原理可以提取γ－G。這種提取法流程大大縮短，純化前后樣品體積變化不大，而且所得γ－G無變性現象。經過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。
⑴ DEAE—SephadexA—50的處理。取DEAE－SephadexA－50若干克，懸浮于蒸餾水中，1h后傾去上層小顆粒，然后用0.50Mol/L NaOH處理1h，蒸餾水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl處理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。
⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液體體積1/4的濾干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不時攪拌、抽濾、收集濾液。
⑶ 再用同樣重量的DEAE－SephadexA－50處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為γ－G制品。
⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（OD280﹤0.04）后，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。
（四）禽血清IgG的分離與提純（Na2HPO4法）
1．試劑
⑴ 5％葡聚糖硫酸鹽
⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
⑶ 無水硫酸鈉
⑷ pH8.2硼酸鹽緩沖液
⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
2．操作方法
⑴ 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸鹽液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，靜置，然后離心去沉淀，此步目的是為了去掉脂類物質。
⑵ 于上清液中加無水硫酸鈉使每毫升血清含0.18g，緩慢加入，混勻，靜置30min，3 000r/min離心去上清。
⑶ 以pH8.2硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成0.16g／ml，同上法離心去上清。
⑷ 重復步驟⑶，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
⑸ 以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后裝透析袋除鹽48h。
⑹ 過SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
⑺ 如要進一步提純，則用第二峰再過DEAE—纖維素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗脫下來的蛋白液即為IgG。
也可以按以下操作方法進行：
⑴ 以18％硫酸鈉（W/V）提取一次，再以14％的硫酸鈉提取一次。
⑵ 將粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入無水硫酸鈉，離心。再將上清按5％加入無水硫酸鈉，離心。將兩沉淀溶解、混合，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中4℃透析，直至無SO42-為止。
⑶ 離心將上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
⑷ 過SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脫，收集洗脫液，取第二峰即為雞IgG。
二、IgM的分離與提純
（一）材料
1．血清
2．葡聚糖凝膠G200
3．洗脫液0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl或0.1Mol/L pH8.0 Tris－HCl+0.14Mol/L NaCl）。
（二） 操作方法
選取2.50cm×90cm層析柱，用葡聚糖凝膠G200裝柱，平衡后，直接加血清樣品10ml或硫酸銨粗提制品，洗脫液洗脫，流速0.25ml/min，分管收集，測OD280值，第一峰即為IgM。將第一峰的數管混合，濃縮、鑒定。
二、 IgA的分離與提純
（一）材料與試劑配制
1．DEAE52纖維素
2．0.10Mol/L ZnSO4液
ZnSO4·7H2O 2.88g
加水至1 000.00ml
3．飽和硫酸銨溶液
4．10％EDTA—Na
5．SephadexG200
6．0.01Mol/L pH7.4PB液
7．0.10Mol/L pH6.4PB液
8．血清
（二）操作方法
1．取血清加等量的0.1Mol/L ZnSO4液，調pH至7.0，室溫攪拌1h，離心去沉淀。
2．于上清液中加入等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置30min或冰箱過夜。
3．10 000r/min離心10min，去上清。
4．取沉淀溶于4ml10％EDTA－Na溶液中。
5．生理鹽水中透析除鹽。
6．過DE52柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫蛋白（IgG）棄去。
7．換用0.1Mol/L pH6.4PB液洗脫，收集蛋白峰，即為IgA。
8．再過SephadexG200柱，洗液為0.01Mol/L pH7.4PBS（0.14Mol/L NaCl），收集洗脫液測OD280值，取第一峰即為純化IgA。
9．透析、濃縮、鑒定。
四、分泌型IgA的分離與鑒定
（一）材料與試劑
1．初乳
2．SephadexG200
3．0.10Mol/L pH6.8PB液
4．0.01Mol/L pH7.4PB液
5．DEAE52
（二）操作方法
1．取初乳20ml，10 000rpm離心10min，棄去表面脂肪層及底部的沉淀物。
2．取乳清過SephadexG200柱（柱規格為2.50cm×90cm），以0.10Mol/L pH6.8PB液洗脫，第一峰為IgA（含IgG）。
3． 收集乳液，于0.01Mol/L pH7.4PB液中透析。
4． 將透析液濃縮至5mg/ml以上。
5． 過DE52層析柱，用0.01Mol/L pH7.4PB液洗脫，洗下蛋白峰為IgG，棄去。
6． 換用0.10Mol/L pH6.8PB液或0.01Mol/L pH7.4PBS（0.10Mol/L NaCl）液洗脫，
收集洗脫液 ，即為較純的IgA液。
7． 必要時，可再過一次SephadexG200柱。
8． 濃縮，鑒定
五、禽IgA提取與純化
（一）材料與試劑配制
1．禽膽汁
2．飽和硫酸銨溶液
3．0.01Mol/L pH7.4PBS液
4．0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
5． DEAE52-纖維素
（二）操作方法
1．取冷藏的膽汁3Ⅹml，緩慢滴加Ⅹml飽和硫酸銨液，邊加邊攪拌，使成25％飽和硫酸銨液。4℃放置30min。
2． 3 000r/min離心30min，去沉淀。
3． 取上清，加飽和硫酸銨液，使成35％的飽和度，4℃放置30min。
4． 3 000r/min離心30min，棄上清。
5． 取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加飽和硫酸銨溶液，重復步驟3和4三次。
6． 將沉淀用0.85％NaCl液溶解，裝入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
7． 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，過DEAE52纖維柱（20×250mm）。
8． 取透析樣品4ml(﹥20mg/ml蛋白濃度)加入層析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫。
9． 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl濃度為0.30Mol/L）洗脫，收集洗脫液。
10．濃縮洗脫蛋白液至20mg/ml，分裝，低溫冰箱保存。
六、IgE的分離與提純
（一）材料與試劑
1．血清
2．飽和硫酸銨溶液
3．洗脫液0.005Mol/L pH7.4PB液
0.025 Mol/L pH7.4PB液
0.01Mol/L pH7.4PBS液(0.14mol/L NaCl)
4．DE52
5．SephadexG150
（二）操作方法
1．取血清倍比稀釋后，加等量飽和（NH4）2SO4溶液，鹽析。
2．離心取沉淀，溶于少量生理鹽水中，透析、除鹽。
3．過DE52柱，以0.005Mol/L pH7.4PB液洗脫，收集洗脫蛋白峰(IgG)，棄去。
4．換以0.025Mol/L pH7.4 PB液洗脫，洗下的蛋白峰主要是IgE。
5．透析除鹽。
6．過G150柱，以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.14Mol/L NaCl)洗脫，收集洗脫液即為純化的IgE。
7． 濃縮、鑒定。
七、連續提取免疫球蛋白法
（一）試劑及配制
1．飽和硫酸銨液
2．各種磷酸鹽緩沖液
⑴ 0.2mol/L原液
A液：0.20Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·H2O 31.20g
H2O 1 000ml
B液：0.20Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.7g
H2O 1 000ml
⑵ 0.10Mol/L pH8.0PB液
A液： 53ml
B液： 947ml
H2O 加至 2 000ml
⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml，加H2O至2 000ml
⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml，加水至2 000ml。
⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml，加水至2 000ml。
⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液
A： 920ml
B： 80ml
H2O 加至 2 000ml
⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液
a液.0.40Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 62.40g
H2O 加至 1 000ml
B液.0.40Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 143.4g
H2O 加至 1 000ml
取a液 960ml
b液 40ml
混合即可。
⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液 100ml
NaCl 8.20g
H2O 加至 1 000ml
3．DEAE-纖維素(細粒級)
4．SephadexG200
（二）操作方法
1．取一定量的血清，加等量的生理鹽水，然后逐漸滴加飽和硫酸銨溶液，使成40％的飽和度,靜置30min。
2．10 000r/min離心10min，去上清。
3．加入一定量的生理鹽水，使沉淀溶解，再加入飽和硫酸銨溶液，使成40％飽和度。10 000r/min離心10min，去上清。
4．再重復步驟3一次。
5．將沉淀以少量生理鹽水溶解，透析，除鹽濃縮。
6．制備DEAE-纖維素柱，以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
同時制備SephadexG200凝膠柱，以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并進行洗脫。
7．以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脫，得蛋白液為IgG。
8． 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脫，得蛋白主要是IgE，再過SephadexG200凝膠柱，收集第一峰即為純IgE。
9．以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脫，得蛋白主要是IgA，再過SephadexG200凝膠柱，收集第一峰即為純IgA。
10．以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脫，洗脫液主要有IgM、IgG及白蛋白的混雜物。
11．以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脫，得蛋白液主要是IgM。過SephadexG200，收
集第二峰即為純IgM。
八、Fab片段的制備方法
利用胃蛋白酶分解IgG，將抗體斷鏈為Fab和Fc片段。具體操作方法如下：
1．將IgG粉末100mg，溶于2ml0.10Mol/L pH4.0醋酸緩沖液。溶液稍成白濁，30℃，保溫10min。
2．取結晶胃蛋白酶1.50mg，溶于1.50ml 0.10Mol/L pH4.0醋酸緩沖液，加入上述溶液中，于30℃作用16h。
3．用0.10Mol/L pH8.0 PBS透析一夜。
4．加入硫醇使成0.10mol/L，在室溫下攪拌30min。
5．加入1Mol/L的碘乙酰胺（Indoacetamide）使成為0.10Mol/L，室溫下攪拌1h。