IAC 作用的基礎是色譜法與抗原抗體的可逆反應平衡相結合的理論,遵循經典的 Scatchard方程。因此,影響 IAC 效率的因素有很多。
①柱容量:免疫親和柱常用的柱床體積為1mL。其高效特異性保留能力,使之能在較小的柱容量或柱床體積下完成凈化過程,減少了非特異性吸附并節省了昂貴的柱材和抗體。另外,柱容量與抗體的偶聯量有很大關系,但并非無限制成正比。因為活化的凝膠中與抗體蛋白結合的活化基團數量是有限的,與活化基團結合達到飽和時,理論柱容量達到最大。此外,親和柱偶聯的抗體濃度過高,抗體之間產生相互作用,將影響抗體與抗原的結合,降低柱容量。
②基質的選擇:針對各種類型的藥物分子,可以選擇不同的基質,以便有效提高凈化效率。適宜的基質對于活化劑的選擇、抗體的偶聯、抗原抗體相互作用及無關雜質的去除,都有著舉足輕重的作用。作為親和柱的載體,最好是均一的珠狀顆粒。溴化氰活化的瓊脂糖(sepharose)是最經典的親和柱的柱材。其他基質應用也很多,如 Kaster 等對纖維素作為 IAC 基質的顆粒大小、柱的耐受力、動力學容量等都進行了很好的描述。
③基質的活化與抗體的偶聯:活化與偶聯反應條件要求溫和、簡單,盡可能降低對抗體的活性和基質結構的破壞。基質活化通常在骨架上引入強親電基團,然后與抗體上的親核基團如—NH2、—OH、—SH 等發生取代反應,使抗體連接于基質上(偶聯)。雖然抗體的化學特性直至20世紀中葉才被揭示,利用抗體進行分析卻已有百年的歷史。抗血清中的抗體含量最多的是 IgG,所以常用其制備免疫吸附劑。已有人研究多樣性的抗原結合片段對增加識別位點濃度的各種優點,但實驗室還沒有廣泛的應用,如 Fab 片段很容易從單抗或多抗中獲得,這種片段已被用作在線偶聯毛細管電泳的免疫吸附劑。IAC 技術應用的抗體有兩種類型,即單克隆抗體(McAbs)和多克隆抗體(PcAbs)。與單抗相比,多抗的抗原決定基的特異性和結合特性是多樣的,因此制備時使用純抗原,以防止產生不必要的抗體。但是多抗包含了所有的抗體亞類,對變性條件的抵抗力也高于單抗,因此多抗制備的IAC 柱壽命較長。抗體偶聯分為隨機偶聯和定向偶聯兩種,隨機偶聯的抗體以其不同部位隨機偶聯到同相載體上,將導致抗體與抗原結合的活性位點變少,損失結合力,完全隨機偶聯會損失66%的結合力。定向偶聯的抗體偶聯到基質后抗原結合位點指向流動相,抗體偶聯部位應為 Fc 片段、末端蛋白或通過連接分子偶聯。可以應用來自葡萄球菌細胞壁的PrA 與 PrG 結合抗體分子的 Fc 部位,也可用胃蛋白酶水解抗體,產生 Fab 或單鏈抗體(Fv),其 C 端巰基定向固定于基質。
④抗原抗體結合能力:Preiffer 等在評價應用單克隆抗體的 IAC 中影響抗原結合能力的因素時提到,因為抗體與瓊脂糖基質的結合是多價結合,所以影響了與抗原的結合能力,因此在選擇偶聯條件時,一定要使抗原結合能力最大化;激活劑的濃度也影響抗原結合,在使用 CNBr 激活基質時,為了使抗體偶聯后有較大的抗原結合能力,要嘗試不同濃度的CNBr,且過高濃度的溴化氰活化的瓊脂糖會使抗體蛋白偶聯在膠珠外部,而不能滲透到里面,從而影響了抗原結合能力。合適的 pH 值能減少抗體的多點結合而提高抗原結合能力。抗原抗體相互作用的基礎是分子互補的空間化學結構,并在抗原抗體間形成一系列復雜的范德華力、庫侖力、疏水作用、氫鍵及立體構象互補。由于抗原抗體結合強度很大,從免疫親和柱上洗脫抗原是此項技術中的關鍵步驟。洗脫抗原時,柱的環境必須改變,使Ka 值下降。
⑤流動速率與柱壓:流動速率應與抗原抗體反應速率相匹配,流動速率高則結合反應效率低,一般的流速在0.4～4.0mL/min。不同的反應體系要確定各自的最佳流速。免疫親和柱的柱壓一般低于正常柱壓,過高的壓力(>3.4×106Pa)會對柱產生剪切力,破壞抗原抗體的結合,降低柱的效率,還有可能將柱料作為雜質混到分析物中。一般來說,為了防止抗體脫落,壓力最大值應為0.34×106Pa。