從正常人和骨關節炎患者關節軟骨分離軟骨祖細胞實驗2

骨關節炎患者全關節置換得到的脛骨滑膜；需要正常組織時使用新鮮的尸體組織

DMEM(包含4.5 g L葡萄糖和4 mmol L L-谷氨酰胺）黏附培養基：含100μg ml慶大霉素的DMEM克隆生長培養基：DMEM10% FBS和100μg ml慶大霉素胎牛血清牛血清白蛋白（BSA) 用PBSC配成10μg ml血清纖連蛋白 1mg ml

Nitex細胞濾網40μm篩孔解剖刀片 10號和23號解剖刀柄 3號和4號鑷子 2對離心管50ml礦油凝膠（凡士林）克隆環 6 mm

A.組織收集和細胞分離

(a)在無菌條件下，小心從關節周圍剪下滑膜，戴好鎖子甲手套的手固定平頂。

(b)將滑膜移至含PBSC的Petri培養皿中，在解剖鏡下用鑷子取出脂肪組織（見注釋1)。

(c)將清潔后的滑膜移至新的含PBSC的Petri培養皿中（見注釋2)。

(d)用刀片和鑷子分離組織，與10 ml消化培養基一起移至普通器皿（見注釋3)。置于滾轉機上37℃過夜。

(e)加入黏附培養基，300g離心10min洗滌細胞2次。用黏附培養基重懸，2 ml中含4000個細胞。

(f)40μm Nitex細胞濾網過濾。

B.差別黏附測定（見圖10.1)

(a)用纖連蛋白包被3.5cm Petri培養皿（或12孔板），4℃過夜。陰性對照使用10μg/ml BSA。

(b)滴加2 ml細胞懸液至包被的培養皿，于5% CO₂孵箱中靜置20 min。

(c)吸出未貼壁細胞，棄之。

(d)加2ml生長培養基培養10天，于在第5天更換新的培養基。

C.克隆和細胞擴增（見注解5)

(a)集落（>32細胞）生成同軟骨祖細胞

(b)按1個克隆/孔將細胞移至12孔板，加入含bFGF和TGF-β1的擴增培養基

(c)繼續擴增細胞，將細胞從12孔板移至6孔板，再到25cm²，最后到75cm²培養瓶中。

D.分化

誘導分化的步驟基本與軟骨祖細胞相同。但是，需注意培養基式不同。實驗體系中14天時基質中出現Ⅱ型膠原的未成熟形式（Ⅱa）。成熟膠原（Ⅱb型)的表達需要較長的培養時間。

注解

（1）若組織中有很多黏附的脂肪，使用23號刀片和3號刀柄比較容易操作。

（2）Hank’s平衡鹽溶液（HBSS）可以取代PBSC。

( 3 )較大的組織量可以用50 ml管和30 ml培養基。

( 4 )若使用培養皿做差異黏附測定，觀察克隆時，用記號筆在培養皿蓋子上打點對克隆進行標記，觀察克隆時據此定位。

( 5 )若克隆細胞系擴增緩慢，向培養基中加入5 ng/ml PDGF也許有所幫助