從正常人和骨關節炎患者的關節軟骨中分離軟骨祖細胞實驗
實驗方法原理
實驗材料 人關節軟骨
試劑、試劑盒 胰蛋白酶 EDTA:胰蛋白酶（0.05%)和EDTA(0.53 mmol L)PBSA配制胎牛血清牛血清白蛋白（BSA)10μg ml和1 mg ml PBSC配制血清纖連蛋白 10μg m1 PBSC配制
儀器、耗材 尼龍膜40μm篩孔（“細胞濾網”）離心管50ml 帶圓錐底部便于細胞離心解剖刀片鑷子 2對（1大1小）礦油凝膠（凡士林）克隆環 6 mm微量離心機分離軟骨用的鎖子甲手套記號筆
實驗步驟
A.組織收集和細胞分離
(a)無菌條件下，用10號解剖刀片小心從軟骨下骨下面解剖軟骨（見本方案后的注解1)。將軟骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培養皿中。
(b)用鑷子和刀片仔細將軟骨切成1 mm3小塊。
(C)將軟骨小塊轉移至含18 mL鏈霉蛋白酶消化培養基的普通器皿或離心管中。
(d)置于滾轉機37℃處理1 h。
(e)吸出消化液棄之。
(f)加人18 ml膠原酶消化培養基，再次置于滾轉機37℃處理1 h。
(g)細胞濾網過濾,，
(h)用血細胞計數板進行細胞計數。
(i)加人黏附測定培養基，620g離心10 min進行洗滌，用黏附培養基以2000個細胞/ml密度重懸細胞（4000個細胞）。
B.差異黏附測定
(a)用10μg/ml纖連蛋白包被3.5cm Petri培養皿，4℃過夜。陰性對照使用10μg/ml BSA。
(b)吸出液體，用含1 mg/ml BSA的PBSC封閉培養皿30min。
(c)加人2 ml培養基重懸的細胞懸液靜置20 min。
(d)吸出培養基和未貼壁細胞，置于第二個培養皿中20 min。
(e)向第一個培養皿中加人2 ml生長培養基后置于鮮箱。
(f)從第二個培養皿中吸出培養基和未貼壁細胞至第三個培養皿中。
(g)向第二個培養皿中加人2 ml生長培養基后置于孵箱。
(h)向最后一個培養皿中加人200μl FBS后置于孵箱。
(i)3 h后，用相差顯微鏡計數最初貼壁的細胞。
(j)培養細胞，至明顯可見多于32個細胞的集落（見注解2)，一般需10天。
(k)用以下公式計算集落形成率（GFE):
CFF=χ天的集落數/0天貼壁細胞的細胞數
集落擴增
(a)用相差顯微鏡鑒定多于32個細胞的細胞集落，在培養皿下用記號筆將其畫圈標記（見注解4）
(b)計數和記錄每個集落的細胞數
(C)從Petri培養皿中吸出培養基，用PBSA潤洗。
(d)在克隆環上無菌涂抹凡士林，或者使用無菌鑷子直接將其浸人凡士林
(e)將克隆環置于集落上（見注解5)，向圈中加入胰蛋白酶/EDTA溶液5?10 min—相差顯微鏡觀察細胞已脫離。
(f)重懸細胞，置于Eppendorf管中，300g離心5min(見注解6)
(g)生長培養基洗滌，重復上述離心。
(h)生長培養基稀釋，12孔板中每孔接種1個集落。
(i)細胞匯合時接種至3.5cm培養皿(或6孔板），然后再移至較大培養瓶25cm2，75cm2最后為175cm2。
注意事項
其他
注解:
⑴ 解剖小塊軟骨或單個髁狀突時，解剖過程巾用大鑷子抓牢將其固定，如果解剖整個骨髁，戴好領子甲手套（乙醇清洗）固定關節。軟骨很滑，并且髁狀突呈彎曲狀，很容易割傷自己！表面滴加滅菌PBSA可保持軟骨濕潤。
⑵ 擇大于32個細胞的集落，需注意避免選擇可形成過渡放大群的細胞（祖細胞的直接后代），它們正常可擴增5個群體細胞倍數（PDs)。'
⑶可以通過實驗觀察和借助顯微鏡等一系列方法標記集落，例如，通過物鏡放大后進行標記。有些人直接將克隆環放在集落上，在層流通風櫥中使用顯微鏡。標記圈應適合倒置顯微鏡的物鏡轉換盤，可從Nikon獲得。
(4)如果需要精確判定細胞所經過的集落擴增倍數，計數每個集落中的細胞尤為重要。
(5)確保要標記的集落間有足夠的空間以避免污染；或者可能的話將克隆環縮小
(6)如果使用較小的克隆（35?50個細胞），Eppendorf洗滌的步驟可以省略，將帶有胰蛋白酶/EDTA的細胞直接轉移到12孔板中，所含的2 ml生長培養基足夠中和
(7)軟骨的細胞外基質均隨年齡增多。所以，消化時間隨著供者的年齡有所變化，年輕供者的組織較短的時間即可完全消化。應切記盡量縮短使細胞脫落的消化時間以保證最大的細胞存活率。在膠原酶中以小時間隔進行急劇攪拌可加速組織溶解過程。作為指導，每克軟骨中至少加7 ml消化液，超過此體積無妨但浪費試劑。如果是年齡很小的供者，參考以下的胎兒軟骨操作步驟。
(8)克隆細胞系轉移至6孔板或3.5cm petri培養皿,生長良好時，幾天內可匯合，按1:2稀釋度傳代。更大比例的稀釋（1:4或1:8)可應用于更成熟的培養物。
(9)使用膠原酶時單位活性很重要，因為不同批次間可相差3倍。建議做批次試驗。