臨床化學定量測定方法的可報告區間

　　自2005年中國合格評定國家認可委員會（CNAS）開始進行醫學實驗室認可工作以來，參與并通過醫學實驗室認可逐漸成為醫學實驗室檢測能力的表征。越來越多的臨床實驗室開始關注認可要求并著手開展相關工作，對檢驗程序進行驗證與確認則是其中的重要環節。CNAS-CL02-2012規定“在常規應用前，應由實驗室對未加修改而使用的已確認的檢驗程序進行獨立驗證”，“實驗室應對非標準方法、實驗室設計或制定的方法、超出預期使用范圍的標準方法及修改過的確認方法進行方法確認”[1]，在CNAS-CL02-A003:2018中指出“檢驗方法和程序的分析性能驗證內容至少應包括正確度、精密度和可報告范圍”，“如果使用內部程序，如自建檢測系統，應有程序評估并確認正確度、精密度、可報告范圍、生物參考區間等分析性能符合預期用途”[2]。可見無論是對檢驗程序進行驗證還是確認，正確度、精密度與可報告范圍均是必不可少的性能特征。有關正確度與精密度的確認與驗證已有很多相關文獻，本文將主要闡述對于可報告范圍的確認與驗證。

　　可報告范圍（reportable range）近年來常被稱為可報告區間（reportable interval）。在ISO/IEC Guide 99:2007中開篇即對區間（interval）與范圍（range）的不同含義進行了說明，簡要理解為區間是一個實數集合，而范圍則是區間兩端實數的差值[3]。從這一說明來看，上文中的可報告范圍及隨后將提及的測量范圍 、線性范圍等均為實數集合，因此采用“區間”的表述更為嚴謹。

　　ISO/IEC Guide 99:2007中詞條4.7給出了測量區間的定義，“在規定條件下，可由給定測量儀器或測量系統以規定的儀器不確定度測量的相同類量的量值的集合”[3]。ISO18113-1:2009中詞條3.46對于測量區間也給出了相同的定義，同時在該定義的注1中將可報告區間解釋為“體外診斷醫療器械性能特征已被確認（validated）的測量區間被稱為可報告區間”[4]。美國臨床實驗室改進法案規則(CLIA’88) 493.2中給出了另一個應用較廣的可報告區間定義，“實驗室可建立（establish）或驗證（verify）儀器或測量系統響應準確性的測量結果區間”[5]。對測量系統性能特征的確認與驗證本質上都是為了給測量結果的準確性提供證據，因此上述關于可報告區間的定義其內涵是相同的。

　　測量區間的定義著重于所屬區間內的任一量值由符合目標不確定度要求的測量系統給出，可報告區間定義的重點在于所屬區間內的任一量值由符合準確度要求的測量系統給出，除非目標不確定度與準確度要求不同，否則在多數情況下，測量區間與可報告區間應是相同的。

　　那么，可報告區間的下限與上限該如何確定呢？

　　可報告區間下限的確定與測量系統的檢出能力有關。測量系統的檢出能力通過三個性能參數表征，分別為空白限（limit of blank, LoB）、檢出限（limit of detection, LoD）與定量限（limit of quantitation, LoQ）。LoB是在聲稱概率下，測量空白樣本時觀察到的最高測量結果[6]。LoD則是在聲稱概率下，測量系統能檢出的最低分析物濃度，此分析物成分不存在的誤判概率為β，存在的誤判概率為α[3]。LoQ是滿足聲明的精密度和正確度，在聲明的實驗條件下能夠可靠定量的分析物的最低濃度，也稱為定量低限（lower limit of determination/quantitation, LLoQ）[6]。雖然LoB與LoD的評估均基于測量系統的變異和Ⅰ類及Ⅱ類錯誤概率的設置，但LoB是分析物并不存在時測量系統的最大響應，LoD則是測量系統對樣本中微量分析物濃度的真實響應，雖然不能做到可靠定量，但指示了分析物的實際存在，當采用CLSI EP17中的方案評估檢出能力時，LoB的數值要小于LoD。LoQ表明測量系統能可靠定量的最低分析物濃度，是僅適用于定量測量程序的性能特征，其估計值與設定的準確度目標相關。可報告區間/測量區間的下限即為LoQ。

　　可報告區間上限的確定與線性區間相關。定量檢測方法的線性指測量系統的測量結果與樣本中分析物濃度成正比的能力。線性區間則是測量系統的非線性誤差在預先設定的誤差界值之內的量值區間[7]。美國臨床病理學會（College of American Pathologists，CAP）提出了分析測量范圍（Analytic Measurement Range, AMR）的概念，指樣本未經稀釋、濃縮或其他不屬于常規操作過程的預處理時，由測量程序直接測量的樣本濃度范圍，在AMR范圍內，測量系統的測量結果與樣本濃度應為線性關系[8]。CLSI EP34規范了此概念的表述方式，稱為分析測量區間（Analytic Measurement Interval, AMI），在明確樣本應未經稀釋、濃縮或其他不屬于常規操作過程的預處理的同時也強調了AMI是測量系統以符合臨床與實驗室的準確度需求測量的樣本濃度區間[9]。AMI涵蓋區間的線性、精密度與偏倚的可接受性均已經過驗證。結合線性區間的評估方案與AMI的定義，可認為線性區間與AMI代表的是同一個量值區間。線性區間的上限即為方法的定量高限（upper limit of quantitation, ULoQ）。為滿足臨床需求，有時要對分析物濃度超出AMI的樣本進行準確定量，此時建立一個有效的樣本稀釋程序是非常必要的。通過這一樣本稀釋程序可確定分析物濃度超出ULoQ時最適合的稀釋液及稀釋因子，同時也得到了方法的擴展測量區間（extended measuring interval，EMI）。CLSI EP34中對EMI的定義為樣本按照預設操作過程經過稀釋處理后，由測量系統以符合適當準確度需求測量的樣本濃度區間[9]。此區間的上限為ULoQ與稀釋因子的乘積。稀釋程序的建立與驗證保證了EMI符合適當的準確度需求。EMI的上限即為可報告區間/測量區間的上限。

　　至此對可報告區間已經了解：1.區間下限為LoQ，2.區間上限為EMI上限，3.可報告區間內包含兩種區間，分別為線性區間與EMI。可報告區間的驗證可分解為對多個性能特征參數的驗證。從區間的下限到上限分別為：LoQ、線性區間/AMI、EMI。這些參數的驗證均有相應的CLSI標準或國內衛生行業標準，CNAS針對醫學實驗室認可也編制了相應的性能驗證指南。下表對相關文件與標準進行了匯總。

　　除了表中所列文獻外，衛生行業標準WS/T 420-2013中部分內容也涉及到了商品定量試劑盒的線性區間驗證[10]。此標準中有關線性區間驗證的實驗設計、樣本制備與測定等具體操作步驟與CLSI EP06-A和WS/T408-2012沒有明顯差別，但在數據處理方式上采用了不同的統計學假設。CLSI EP06-A與WS/T408-2012采用了多項式法進行線性評價，首先假定數據組是非線性的，然后通過對多項式中非線性系數的統計學檢驗以證實方法的統計學線性，并對非統計學線性的情況進行臨床線性的評估，同時也考察測量精密度對線性評估有效性的影響[7,11]。WS/T420-2013則假定數據組應該為線性，據此對數據進行線性回歸處理，并通過決定系數（r^2>0.995）和實測值與擬合值間的差異（不大于廠家聲稱值）對結果進行判讀[10]。WS/T420-2013中的方法大大減少了數據處理難度，用于線性區間驗證時簡單省時，但這種方法在一定程度上降低了評估結果的可靠性與嚴謹性，正如在其適用范圍內所述，此標準不適用于廠家或實驗室對測量系統的線性區間進行確認。

　　實驗室在進行線性區間驗證時還經常遇到的一個疑問是，線性區間的下限能否為零？這一問題的解答可從文中提及的5種與低濃度水平檢測能力相關的性能參數著手，這些參數分別為可報告區間的下限、線性區間的下限、LoB、LoD與LoQ。線性區間的評估方案中需要預設非線性誤差，非線性誤差也是一種準確度指標，合理設置的非線性誤差應當與目標不確定度是等效的，此時線性區間的下限也是LoQ，即可報告區間的下限。大多數情況下，LoB應小于LoD，而根據可接受的準確度目標，LoQ可等于或高于LoD。因為LoB不可能為零，故在進行線性評估時，線性區間的下限是不能為零的。

　　可報告區間的驗證并非一個孤立的過程，精密度、正確度、檢出能力等諸多測量系統性能特征參數的驗證組成一個有序的整體，在進行可報告區間的驗證前，至少要先進行精密度與正確度的驗證。在選用何種驗證方案時，需要考慮各方案的適用范圍及有無特殊要求。如在進行醫學實驗室認可時，最好采用相關指南中給出的驗證方案。

　　2018年出版的CLSI EP34中提出可報告區間包括AMI與EMI，并將可報告區間的下限由LoQ下延至LoD[9]。而如上文所述，可報告區間與測量區間是一致的，在ISO/IEC Guide 99:2007測量區間的定義中明確指出不要將測量區間下限與LoD相混[3]，因為LoD與LoQ的評估基于不同理論，位于LoD與LoQ之間的結果雖也能以數值表示，但有較大的不確定度，不能認為LoD與LoQ之間的結果是可靠定量的。因未見到CLSI EP34原文，對于文中這一說法的原因未知。但無論是何原因，這一觀點可能使可報告區間的定義發生改變。此時對可報告區間的驗證還應包括對LoD的驗證。